流式细胞FC

流式细胞术Flow CytoMetryFC)用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。FC是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号,实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。

特点

Ø  可用于单细胞悬液/生物颗粒

Ø  分析速度快

Ø  多参数,可同时分析单个细胞的多种特征,使细胞亚群的识别、技术更为准确

Ø  精度高

Ø  定性定量分析

基本原则:

1. 保证样本新鲜,尽快完成样本制备检测

2. 针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或EDTA处理,以清除杂质,使粘附的细胞彼此分离而形成单细胞状态

3. 对新鲜实体瘤组织可选用或联用酶消化法,机械打散法和化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液

4. 石蜡包埋组织应先切成若干 40-50um 厚的蜡片,经二甲苯脱蜡脱水后再制备单细胞悬液

5. 单细胞悬液的细胞数不应少于10000个。

流式细胞仪原理:

待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后制成样品悬液,在一定压力下通过壳液包围的进样管而进入流动室,排成单列的细胞,由流动室的喷嘴喷出而成为细胞液流,并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光,由放在与入射的激光束和细胞液流成 90°处的光学系统收集之。光学系统中的阻断滤片用于阻挡激发光;二色分光镜及另一些阻断滤片则用于选择荧光波长。荧光检测器为光电倍增管。散射光检测器是光电二极管,用以收集前向散射光。小角度前向散射与细胞大小有关。

整个仪器用多道脉冲高度分析器处理荧光脉冲信号和光散射信号。测定的结果用单参数直方图、双参数散点图、三维立体图和轮廓(等高)图来表示。

对细胞进行分选的原理是,由超声振荡器产生高频振荡,使流动室发生振动,把喷嘴喷出的细胞液流断裂成一连串的均匀小液滴,有的液滴含有细胞。这些细胞在形成液滴前,光学系统已测定了它们的信号(代表细胞的性质),如果测得信号与所选定的要进行分选的细胞性质符合,或者说,如果发现了要进行分选的细胞时则在这个选定细胞刚形成液滴时,仪器给整个液流充以短暂的正或负电荷。当该液滴离开液流后,其中被选定细胞的液滴就带有电荷,而不被选定的细胞液滴则不带电。带有正电或负电的液滴通过高压偏转板时发生向阴极或向阳极的偏转,从而达到了分类收集细胞的目的。