实验方法：

直接法：将特异性荧光抗体直接加在固定的待检标本上（含抗原），使之形成抗原-抗体复合物，以鉴定未知抗原。并可根据荧光的分布和形态，确定其抗原性。本法的优点是简便、快速、特异性强；缺点是不能用已知抗原检测未知抗体，而且检测每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，其敏感性较差。常用于细菌、病毒的快速检查。 

间接法：又称双抗体法。利用荧光标记抗体鉴定未知抗原或未知抗体，荧光标记的抗球蛋白抗体可检测各种未知抗原或抗体，其敏感性比直接法高5～10倍，缺点是参加反应的组分较多，步骤繁杂，所需对照多。常用于各种自身抗体的检测。

补体法：利用荧光素标记抗补体抗体，以鉴定未知抗原或抗体。本法仅需一种标记抗补体抗体，由于补体与抗原-抗体复合物结合无种属特异性，从而不受已知抗体或待测血清的动物种类限制，故可检测各种抗原-抗体系统。缺点是容易产生非特异性干扰，需要较多的对照，补体由于不稳定，不易长期保存。

双标记法：用异硫氰酸荧光黄（FITC）和四乙基罗丹明（RB200）两种荧光素标记不同抗体，对同一基质样本进行检测，若有相应的两种抗原存在，则显示不同颜色的荧光。 

实验步骤：

1. 样品制备

贴壁细胞：将细胞接种于爬片中，生长至一定密度时（约70%）可进行后续操作。

悬浮细胞：在悬浮液中直接进行固定染色，离心洗脱后将细胞移至拨片进行后续操作。

冷冻切片：直接进行固定及后续操作。

石蜡切片：需提前进行脱蜡和抗原修复（石蜡切片基本不用于IF实验）。

2. 固定

为防止离体组织自溶抗原扩散，使用固定液对样品进行固定，细胞样品通常固定10-15min，组织切片通常固定18-24h。固定液的选择主要取决于抗原的特性，常用固定液包括4% PFA、4%多聚甲醛等，但针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择无水甲醇/无水乙醇。

3. 通透

为了抗体可以进入细胞与抗原更好地结合，使用PBS洗净固定液后，加入通透剂，通常使用0.5%Triton X-100室温通透10 min。

4. 封闭

为了降低内源性非特异性蛋白结合，PBS洗净通透液后，加入10%封闭液封闭。封闭液通常为山羊血清、BSA或与二抗同一来源的血清。为避免出现高背景，需保持样品的湿润。

5. 一抗孵育

PBS洗净封闭液后，加入稀释好的一抗4℃湿盒中孵育。

6. 荧光二抗孵育

一抗孵育结束后PBS洗净，加入稀释好的荧光二抗室温湿盒中孵育1h。需注意：由于荧光易淬灭，此过程及其后续操作需避光。

7. DAPI染色

为观察时方便细胞定位，二抗孵育结束PBS洗净后可使用DAPI染色液对细胞核进行染色，室温孵育5-10min。

8. 封片

PBS洗净DAPI后，滴加防荧光淬灭的封片剂进行封片，干燥后可移至显微镜下观察或置于-20℃中保存。

9. 成像

使用倒置荧光显微镜/激光共聚焦进行拍照。