图1  WB实验流程图

1、蛋白提取

目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法 (考马斯亮蓝法)、Lowry法 (Folin-酚试剂法)、BCA法等。

细胞总蛋白的提取：细胞经PBS清洗后加入含磷酸酶、蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行冰上裂解，裂解完成后收集细胞离心取上清并保存。

组织蛋白的提取：取出少量组织剪碎，加入含磷酸酶、蛋白酶抑制剂的组织裂解液进行匀浆，此过程保持4℃操作，裂解后收集上清并保存。

2、蛋白定量

常使用BCA法进行细胞/组织样品总蛋白的测定，通常采取培养箱孵育法或比色分析。

3、SDS-PAGE凝胶电泳

凝胶浓度与蛋白分离范围

根据所孵抗体的kDa大小选择合适的分离胶浓度，依次准备玻璃板，注入分离胶、凝固、注入浓缩胶、凝固，插入梳子。待胶制备完成后，将梳子轻轻拔出，玻璃板放入电泳槽中，加入电泳液。需注意，玻璃板需遵循大玻璃板朝外，小玻璃板朝内的原则放置。

根据测定的蛋白含量，计算细胞/组织上样量，且在细胞/组织蛋白样品中加入SDS上样缓冲液使其终浓度为1×，进行蛋白变性，冷却后上样。注意，上样手法轻柔，以免样品溢出。设置电压，开始电泳，当样品到达玻璃板底部时可停止，准备转膜。

4、转膜

常用的电泳转移方法有湿转和半干转，两者原理相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。

准备合适大小的NC（硝酸纤维素）/PVDF（聚偏二氟乙烯）膜，此外也有实验室使用尼龙膜等，注意PVDF膜使用时需甲醇激活。取出玻璃板中的分离胶胶体，以海绵垫、滤纸、NC/PVDF膜、分离胶胶体、滤纸、海绵垫的顺序放入转膜夹，此过程需注意膜与胶体之间不能留有气泡。将转膜夹放入槽中，设置电流，开始电转。

5、封闭

使用western blot膜封闭液/5%脱脂奶粉/5%BSA溶液进行膜的封闭，通常室温摇床孵育1h，封闭的目的时为了避免一抗与膜发生非特异性结合，导致背景偏高。

6、一抗

使用TBST/抗体稀释液稀释抗体至合适浓度，将膜完全浸入至一抗稀释液中，可使用密闭塑料袋/孵育盒，室温孵育1-5h或4℃过夜。

7、二抗

TBST清洗膜完全后，使用TBST/抗体稀释液稀释二抗至合适浓度，将膜完全浸入至二抗稀释液中，室温孵育1-2h。

8、底物显色

使用ECL试化学发光剂盒，根据说明书混合试剂，孵于膜上，进行化学曝光，根据信号强弱调整曝光时间。