实验步骤:
1.样品准备
细胞上清液:贴壁细胞直接取细胞上清即可;悬浮细胞离心后取上清液。
血清:收集动物血液,12000rpm离心15min,取上清。
血浆:收集血液至抗凝试管,4℃12000rpm离心15min,取上清。
2.蛋白标准品配置
取出试剂盒中的蛋白标准品,使用样品稀释液稀释标准品至说明书设置的浓度梯度。
3.样品孵育
样品稀释后,加入样品及蛋白标准品,37℃孵育1-2h,配置1×洗涤液,孵育完成后洗涤液洗版3-5次,每次300μl。
4.二抗孵育
在所有孔加入100μL稀释后的链霉亲和素-HRP,用封板膜覆盖,37℃避光孵育1小时。孵育完成后洗涤液洗版3-5次,每次300μl。
5.TMB显色
每孔中加入100μL TMB显色液。用封板膜覆盖,室温避光孵育30min。
6.终止读数
每孔加入50μL终止液,A450读数。以标准品浓度为横坐标,读数值为纵坐标绘制标准曲线,带入样品A450值计算相应浓度。